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干细胞治疗缺血性中风的最新研究进展

来源：日期：2021-04-21

卒中（中风）是世界上一种会致残性的、甚至危及生命的疾病，包括缺血性卒中和出血性卒中。缺血性中风约占全球所有中风的79%。据估计，每4个成年人中就有1个会经历中风，全世界有超过8000万不同程度残疾的中风幸存者，中风严重影响了这些患者的生活质量。因此，为了降低死亡率和致残率，寻找有效的治疗方案势在必行。
缺血性中风，是全球范围内的高发疾病，欧洲最为严重。

缺血性中风导致大脑中的缺氧和葡萄糖缺乏，缺氧缺糖引起的线粒体功能障碍发生在缺血后的几分钟内，导致ATP产生耗竭和活性氧簇（ROS）的过量产生，启动了大脑多个组织细胞死亡的级联反应，通过释放促炎细胞因子和基质金属蛋白酶，从而破坏血脑屏障，使得外周炎症细胞（包括中性粒细胞和单核/巨噬细胞）进入脑实质，增加神经细胞死亡。
通过脑血管造影可以确定血栓的位置，从而及时处理。

目前可用的缺血性中风治疗方法是通过溶栓/取栓，从而让血管内再通以恢复血流，减少脑神经细胞因缺血所致的死亡，从而减少残疾和死亡，但都有时间的限制性。以间充质干细胞（MSC）为基础的治疗被普遍认为是中风的新疗法，并已逐渐相续开展临床试验^[4]。MSC因其易获得性、分泌多种生长因子、免疫调节特性和具有穿透血管的能力，而成为治疗缺血性卒中的一个有吸引力的优势细胞选择^[5]。

1，MSC治疗缺血性中风的机制分析

中风时的血流阻断会导致复杂的病理生理过程，包括氧化应激、炎症、血脑屏障的破坏、钙超载、兴奋性毒性和自噬功能障碍，从而导致神经细胞损伤出现的症状^{[2, 6]}。随后的血流再通也会导致继发性损伤，即再灌注损伤。氧化应激和炎症活动是脑缺血损伤级联反应中的两个早期事件，导致许多神经细胞的损伤和神经传递的中断^[7-9]。自噬作为清道夫，在脑缺血时也被激活，对缺血性卒中起双相作用，适当的自噬有助于维持大脑新陈代谢，而自噬失衡会加剧脑损伤。目前认为氧化应激、神经炎症和自噬功能障碍共同作用于脑缺血后的细胞损伤，这三个关节的环节同时也是MSC治疗缺血性中风的机制靶点。但是这三个环节缺少了脑血管这个很重要的影响因素。

活性氧和活性氮的大量产生还可直接引发炎症分子的分泌和炎性小体的激活，从而对神经元、胶质细胞和血管内皮细胞产生有害影响，如细胞器肿胀和坏死、脂质过氧化、蛋白质变性、DNA修饰异常，同时改变血管反应性和破坏血脑屏障。因此，中风患者的血脑屏障的通透性是增加的，这一点有利于MSC较为容易地通过血脑屏障。非常奇怪的是，这一点常常被临床研究者或者MSC研究者所忽视，以至于想当然地认为MSC无法通过“血脑屏障”的限制。在动物模型中，MSC已被证明可以跨越血脑屏障，改善急性缺血性中风后的功能恢复。

机制之一：减少炎症

一般说来，MSC产生的抗炎分子在中枢神经系统中也表现出免疫调节特性。中风后早期应用MSC显著上调了抗炎因子IL-10、IL-1RA、PGE₂和TSG-6的表达水平，降低了脑组织中炎症因子TNF-α的水平。
这些有益的作用与许多过程的调节有关，包括抗炎分子分泌增加，伴随着促炎细胞因子和中性粒细胞的减少，以及修复血脑屏障。MSC修复血脑屏障的另一个途径是通过减轻炎症反应，通过p38信号通路下调蛋白aquaporin-4（AQP4）的表达，减少缺血后星形胶质细胞的凋亡。MSC可以通过降低氧化应激水平来挽救受损的脑组织细胞，避免神经细胞的死亡。MSC还可以通过抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的合成来减轻脑缺血再灌注损伤。适当的自噬活性通过减少氧化应激和炎症活动有助于脑的恢复，而自噬功能障碍则会加重脑损伤。因此，MSC可以通过增强自噬来对抗缺血性损伤。其中BDNF/mTOR信号通路、PI3K/Akt/mTOR通路和Notch2/mTOR通路也参与了MSCs促进自噬的调控过程。也有证据表明，MSC能够通过多种分子途径抑制自噬，进而促进缺血损伤后的功能恢复。研究最多的是MSC激活mTOR通路的能力，包括PI3K/Akt/mTOR通路和PTEN/Akt/mTOR通路。在缺血性中风发作后的早期30min后，出现泛素-蛋白酶体系统（UPS）活性增强，及BAG3/BAG1和LC3-II/LC3-I比值在再灌注24h均显著增加；脑内注射MSC减少细胞的凋亡，抑制了泛素-蛋白酶体系统（UPS）的活性，提高BAG3/BAG1和LC3-II/LC3-I比值，从而显著缩小脑梗死体积。

机制之二：拯救受伤的神经细胞

不管是出血性中风，还是缺血性中风，临床治疗都是要尽量避免神经细胞的死亡，从而减少因神经细胞死亡导致的致残或致死。短暂性局灶性脑缺血诱导星形胶质细胞线粒体进入邻近神经元，促进了受伤的神经元细胞的存活。细胞间线粒体转移给受损的神经元细胞，这代表了一种治疗缺血性中风的新策略，它促进了受损细胞的神经活性、轴突再生长和其他功能恢复。而MSC来源的线粒体转移更是治疗缺血性中风的一种新方法。

大鼠实验证明MSC介导的线粒体转移给受伤的神经细胞，提高了干细胞疗法对受损大脑的治疗效果，更好地促进了中风后的康复。在MSC中增加Miro1的表达可以提高线粒体转移到神经元和星形胶质细胞的效率。给大脑中动脉闭塞（MCAO）的缺血大鼠的脑室内补充健康的人脐带MSC的线粒体，减少了受损神经细胞的凋亡，减少了星形胶质细胞增生和小胶质细胞的激活，进而减轻脑缺血后的再灌注/缺血所致的脑损伤级联反应，缩小了梗死面积，改善了运动功能。 MSC能够通过形成TNTs/GAP连接、囊泡转移或细胞融合，将健康的线粒体转移到受损细胞，从而产生ATP，减轻炎症反应，减少凋亡，最终挽救受损神经元。给受损的细胞补充线粒体将是治疗中风的一种有前途的方法，而健康的MSC是用于治疗缺血性中风的线粒体的很好来源。然而，小胶质细胞释放的碎片化线粒体可以触发A1星形细胞反应并扩散炎性神经变性。因此，在线粒体转移治疗中尽可能保持线粒体的完整性。然而，来自不同组织来源MSC的线粒体表现出不同的特性，脂肪和骨髓来源的MSC的线粒体转移率高于牙髓和脐带来源的MSC，但是牙髓和脐带来源的MSC在抑制细胞在应激下产生的活性氧水平比脂肪和骨髓的MSC更有效。除了线粒体，MSC还可能通过分泌神经营养因子和血管生成因子传递给受伤的神经细胞，传递方式主要胞外囊泡（外泌体），这些因子包括VEGF、BDNF、NGF、bFGF和IGF-1等。早些研究倾向于MSC通过细胞因子的方式拯救受伤的神经细胞，但是现在越来越多的研究集中于MSC向受伤的神经细胞输送线粒体，如前所述。

机制之三：重建血供和修复血脑屏障

缺血性中风的病理变化中，常常是脑血管被堵塞或者细小血管塌陷了。治疗缺血性中风的首要任务是通过溶栓/取栓，从而让血管内再通以恢复血流，从而减少脑神经细胞因缺血所致的死亡。

毛细血管管道由内皮细胞组成，周细胞附在内皮细胞旁边，周边被基底膜和细胞外基质包裹着。成年的血管和内皮细胞处于一个静止的状态，很少激活形成新的分支。基底膜和周细胞阻止内皮细胞离开原本的位置，起到稳定血管结构的作用。低氧和炎症环境这些特异性的刺激能启动血管新生的程序。周细胞的离开和基质基底膜的降解，导致小血管的结构不稳定，增加血管的渗透性。如果没有周细胞的黏附，有功能的新生血管将变得不稳定，而且能快速消失。缺血性疾病难于完全恢复的主要原因也是血管生成的不完全刺激（刺激强度不够），比如动脉粥样硬化、中风、心梗、慢性损伤。不同来源的MSC均能诱导内皮细胞的迁移，包括脐带、羊膜、脂肪、牙髓和骨髓。MSC不仅能促进内皮细胞形成管状结构，而且能稳定这种新生的血管并促进成熟，这种作用依赖于MSC和内皮细胞的直接相互接触，MSC发挥着类似周细胞的角色。更多的证据提示MSC治疗中风是通过减轻炎症、抑制损伤细胞的凋亡、保护神经细胞、促进内源性神经形成和血管生成，而且MSC分泌的促血管新生的细胞因子起到关键的作用。在MSC分泌的胞外囊泡的内容物中，miRNAs是一种内源性表达的小片段RNA分子，功能是调节信使RNA（mRNA）的翻译，同样被发现能调节缺血性中风损伤的病理过程。这些miRNAs主要参与减少神经炎症、ROS产生以及BBB功能障碍，促进血管生成。因此，miRNAs疗法为脑缺血损伤的血脑屏障的修复和脑血管重建提供了一种有吸引力的候选方法。

2，MSC治疗缺血性中风的临床研究

2005年全球首次开展了自体骨髓MSC治疗缺血性中风（亚急性期）的一项I/II期试验，在该试验中，5名患者在中风后5-7周的时候进行了静脉输注了1亿个培养扩增的自体骨髓MSC，与对照组的25名患者相比，接受MSC治疗的患者在移植后3、6和12个月表现出持续的神经学改善。同一研究小组随后进行了一项大规模的双盲临床试验，包括16名MSC治疗患者和36名对照患者；每次注射5x10⁷MSC，相隔2周再次注射一次同等剂量；与对照组相比，MSC治疗的患者显示出更好的功能恢复率和更低的死亡率。随后的2011年日本的一个团队报告了对12例缺血性灰质、白质和混合性病变患者的MSC治疗研究，患者卒中后36-133天静脉注射自体骨髓MSC，没有观察到任何中枢神经系统肿瘤、异常细胞生长或神经恶化，也没有证据表明任何接受干细胞输注的患者出现静脉血栓栓塞、全身恶性肿瘤或全身感染；在细胞输注后1周，磁共振成像评估的平均病变体积减少了20%以上。也有研究团队显示缺血性中风患者自体骨髓MSC两次注射（每次2.5x10⁶/kg，相隔1周）并没有带来功能或神经上的差异。在迄今为止规模最大的MSC临床试验（涉及英国和美国33个治疗中心），2011-2015年，67例中重度缺血性中风患者（急性期）进入MSC治疗组，静脉注射异体骨髓12亿MSC（Athersys公司提供MultiStem产品），在治疗后90天时，治疗组和对照组的患者在神经功能恢复方面没有差异。但是，美国Stemedica公司开展经过低氧培养的骨髓MSC（1.5x10⁶/kg）治疗慢性缺血性中风的临床研究，在6个月时Barthel指数评分增加6.8±11.4分（P=0.002），12个月时增加10.8±15.5分（P<0.0 5），功能恢复良好（Barthel评分≥95）的患者比例从基线的11.4%上升到6个月的27.3%和12个月的35.5%；这些数据证明了静脉输注异体骨髓低氧培养的MSC治疗慢性卒中患者和实质性功能缺陷患者的安全性和有效性。 2020年报道了法国领衔了一项单中心多团队参与、开放标签的随机对照试验，随访时间为2年，评价静脉注射自体骨髓MSC治疗缺血性中风（亚急性期）的安全性、可行性和有效性；在31名登记的患者中，16名患者接受了骨髓MSC，在6个月和2年的随访中，治疗组分别有10和16个不良事件发生，对照组分别有12和24个不良事件发生；MSC治疗对Barthel指数、NIHSS和Modified-Rankin评分没有影响，但在运动相关的NIHSS、Fugl-Meyer评分和相关功能磁共振活动方面有显著改善。

除了静脉注射治疗卒中，一项I/IIa期试验开展局部脑注射MSC治疗慢性卒中，在该试验中18名慢性患者（卒中后6个月至3年）接受了2.5、5或1000万个经过Notch-1基因修饰的异体骨髓MSC（SB623）的立体定向颅内注射（每个剂量组6名患者），围绕梗死灶的立体定向影像引导注射5次，在3、6、12和24个月后，神经功能有了显著的改善。经大脑中动脉M1段单次注入脐带MSC（2x10⁷/每人），三名缺血性中风患者中有两名显示出肌肉力量的改善，2例患者在治疗90天和180天后观察到改良Rankin评分的改善。小样本临床研究的结果发现，在亚急性期内给与单独静脉注射脐带MSC或鞘内注射MSC联合神经干细胞，均可以改善缺血性中风患者的神经功能、残疾程度和日常生活能力。

3，总结和展望

对脑缺血-再灌注损伤涉及复杂的信号通路来破坏细胞，包括氧化应激、炎症活动和自噬功能障碍等等。目前，MSC在实验性缺血性中风的治疗中表现出抗氧化应激、减轻神经炎症和调节自噬的功效，其中大部分得益于其强大的旁分泌活性。更重要的是，MSC的低免疫原性、跨过血脑屏障的能力、靶向基因药物的输送能力，使得MSC以及其来源的外泌体在缺血性中风的临床治疗中有着广阔的前景。 提高MSC的向大脑的趋化能力，同样有利于提高MSC的治疗效果。比如，涂抹在细胞膜上的棕榈酸多肽可以将MSC定向到缺血组织，从而减少细胞在周围器官中的积聚，增加细胞在靶组织中的植入率。随着细胞归巢功能的增强，MSC可以携带miR-133b，从而提高缺血损伤中miR-133b的表达水平，进一步提高缺血性脑中风的治疗效果。似乎急性期首选静脉或动脉内移植，目的是减轻全身和局部炎症，减少神经细胞的死亡，但不需要细胞植入；脑内注射是慢性期的首选，因为在慢性期内，干细胞植入被认为是细胞治疗的目标。大脑中动脉阻塞建立缺血性中风大鼠模型后，第7天通过动脉内、静脉或脑内途径注射骨髓MSC，结果显示经动脉、静脉和脑内途径移植的MSC治疗组较对照组有更大的神经功能改善，而且动脉内注射MSC组的疾病大鼠神经功能恢复的程度和速度最快。

但是，需要明确的是，不管MSC是局部注射还是静脉注射，大量的动物实验均证明MSC进入体内后并不能长期存留，所以MSC在大脑的位置并不能分化为神经细胞，也就是说神经细胞一旦死亡，MSC并不能起到替代的作用。简而言之，MSC治疗慢性中风的效果会很差，只能祈祷奇迹的出现。我们需要铭记一些生命科学相关的常识，比如人死不能复生，神经细胞死了也不能复生，所以最好是在人和细胞死亡之前给予拯救。