间充质干细胞（MSC）来源广泛（常见胎盘、脐带、脂肪、骨髓等等），获取容易，没有伦理问题，能在大规模增殖扩增，本身具有很低的免疫原性，具有非常广泛的应用前景。对MSC进行基因改造，可以扩大MSC的应用适应范围，从而更好地治疗多种疑难疾病。
    肿瘤微环境中含有丰富的促炎细胞因子，可作为MSC的趋化因子。除了肿瘤部位的慢性炎症，肿瘤富含各种趋化因子，如基质细胞衍生因子-1α（SDF1-α）、血管内皮生长因子A（VEGF-A）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和转化生长因子（TGF-β）等，对MSC起到化学诱导剂的作用。因此，MSC适合用于基因改造以治疗肿瘤疾病。MSC可以被多种病毒高效转导多种基因片段，包括外来的基因片段，并能在体外广泛培养扩增，产生足够的细胞数量用于治疗。

    MSC作为载体，大概涉及四个方面的改造，即携带化疗药物、转染抗肿瘤特性的肽和蛋白、转染自杀基因和制备疫苗，现给与简要阐述。

1，携带化疗药物

    通过减少化疗药物在非靶组织中的暴露，定点给药可以提高化疗药物的治疗指数。目前靶向给药的方法主要依赖于纳米药物载体，纳米药物载体可以做到在实体肿瘤中积累。然而，这种被动累积是非常低效的，通常不到5%的注射剂量被输送到肿瘤，而且药物载体在肿瘤内的分布不均匀。有意思的是，MSC可以携带传统的抗癌细胞毒药，均匀地浸润肿瘤组织，并改善治疗剂有效载荷在肿瘤内的分布。
    比如，携带抗癌药物紫杉醇（PTX）的纳米工程MSC可以将细胞中的紫杉醇转移到肿瘤部位，并在几天内释放药物，肿瘤细胞增殖减少，抑制血管生成，并增加肿瘤基质内的凋亡，提高了肿瘤小鼠的存活率，尽管MSC携带的紫杉醇的剂量明显较低。
    然而，MSC没有被用作小分子的载体，可能是因为在不影响其活性或肿瘤趋向性的情况下，很难将小分子固定在细胞中，以实现肿瘤靶向。研究发现MSC表面同样存在外排转运蛋白P-糖蛋白（PGP）。药物外排转运体如P-糖蛋白在这些细胞中的过表达进一步限制了抗癌药物的装载，其中许多药物是外排转运体的底物。
    每个细胞可以装载的药物数量对于在肿瘤组织中实现治疗药物浓度至关重要。另一方面，需要注意的是，负载细胞毒性药物会对MSC的活性和肿瘤趋向性产生不利影响。MSC已经用各种类型的纳米粒子(有机和无机基质)进行了工程改造，以提高其载药量和治疗效果。化疗药物首先被装载到纳米颗粒（NPs）中，然后被MSC吸收，产生所谓的“纳米工程MSC”，那么吸收的效率和由此产生的治疗效果可以大大提高。载香豆素-6染料的聚乳酸纳米粒（PLA-NPs）和脂质纳米囊（LNC）能够以浓度和时间依赖的方式有效地被MSC摄取，而不影响MSC的活性和分化。

    尽管在提高纳米工程MSC的治疗效果方面做了一些努力，但不足的载药能力仍然限制了它们在小分子药物输送中的应用。为了克服MSC载药量有限的问题，人们研究了细胞表面偶联或包括内吞和膜偶联在内的双重载药方式。神经肽可以通过共价结合或通过静电和疏水相互作用介导的物理缔合作用附着在MSC表面。利用细胞膜抗体-抗原相互作用将阿霉素负载的二氧化硅纳米颗粒锚定在MSC上。用一种可生物降解和生物相容性的聚合物聚（DL-丙交酯-乙交酯；PLGA）配制的聚合物纳米颗粒被用来将PTX装载到MSC中。PLGA纳米颗粒在内吞入细胞后会被内溶酶捕获，并在细胞质中滞留数天。一旦药物在MSC内释放，药物可以扩散到细胞外或被转运体排出。

2，转染抗肿瘤特性的肽和蛋白

    已经使用病毒和非病毒载体对MSC进行了基因改造，以分泌一些细胞因子来增强宿主对癌细胞的免疫反应，以及直接介导肿瘤细胞死亡的蛋白因子。通过基因修饰表达抗癌大分子的MSC在各种肿瘤模型中显示出良好的抗癌效果。
     第一次报道基于MSC的癌症基因治疗始于大约2002年，当时人类MSC被改造成表达干扰素-β（IFN-β），增强机体对肿瘤的免疫反应，显著抑制了人黑色素瘤严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠异种移植瘤模型中的肿瘤生长，动物的存活时间延长了，而静脉输注重组IFN-β在同一模型中产生的益处微乎其微。IFN-β对肿瘤细胞有抗增殖和促凋亡作用。由于全身给药的毒性，IFN-β的治疗效果受到限制。表达IFN-β的MSC，用于治疗转移性黑色素瘤和乳腺模型，肺转移瘤，胶质瘤和前列腺癌模型。
     干扰素家族中，除了IFN-β，IFN-α和IFN-γ也被用于基因改造MSC。在小鼠浆细胞瘤模型中，表达IFN-α的MSC可以有效地靶向于肿瘤组织内，通过诱导肿瘤细胞凋亡和减少肿瘤血管的生长而提高了小鼠的存活率。IFN-γ是抑制癌症发展和进展的最重要的分子之一。尽管IFN-γ对癌细胞有积极的杀伤作用，但全身给药与显著的副作用限制了IFN-γ的临床应用，包括恶心、抑郁、发烧和白细胞减少。因此，通过设计表达和分泌IFN-γ的人MSC获得了非常有希望的结果。比如基因编辑表达IFN-γ的MSC在小鼠神经母细胞瘤和肺癌模型中显示出抑制肿瘤生长的作用。
    白介素（IL）是一种调节免疫反应的细胞因子，通过直接杀瘤作用或对内源性免疫系统的积极调节来显示抗肿瘤特性。尽管如此，由于白介素没法做到肿瘤部位精准靶向递送，限制了它们在癌症治疗中的应用。利用MSC向肿瘤部位的趋化特点，基因改造MSC，使得MSC表达白介素，从而在肿瘤局部通过激活细胞毒性淋巴细胞和NK细胞来加强抗癌效果。此外，在多种癌细胞预先转移的动物模型中，表达白介素-12（IL-12）的MSC可以抑制淋巴结和其他内脏的转移，具有抗肿瘤作用。表达IL-2、IL-18和IL-21的 MSC，同样被证明了具有较好的抗肿瘤效果。

    肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL/CD253）是另一种细胞因子，TRAIL可诱导表达死亡受体TRAIL-R1和TRAIL-R2，因而具有很强的抗癌作用，因而改造MSC表达TRAIL，用于治疗和消除肿瘤。同样，通过基因工程表达TRAIL的MSC显示了抗骨髓瘤的活性，并在体外显著地触发了对骨髓瘤细胞的杀伤。基因工程表达S-TRAIL的MSC的杀伤机制是在体外触发caspase介导的胶质瘤细胞系和胶质母细胞瘤干细胞（GBSC）的凋亡。

    也许使用MSC作为癌症免疫疗法的最有创意的创新方法出现在双特异性抗体（bsAb）领域。结合T细胞的双特异性抗体（bsAb）正在成为治疗血液系统恶性肿瘤的一种很有前途的免疫治疗工具。由于bsAb分子质量低和半衰期很短，为了达到临床疗效，必须在很长一段时间内持续向患者输注这些bsAb药物。使用MSC作为bsAb生产的细胞工厂，将能够在患者体内持续生产和分泌bsAb。急性髓系白血病患者的T细胞在分泌MSC的bsAb存在下，随着时间的推移可清除体内白血病细胞。虽然仍处于相对早期的发展阶段，但这些初步研究强调了将bsAb与骨髓间充质干细胞结合以实现强大的抗肿瘤效果的巨大潜力。

3，转染自杀基因

  基因导向酶前药物疗法（Gene-directedenzyme prodrug therapy，GDEPT），或自杀基因疗法，是另一种治疗癌症的新颖方法。简单来讲，系统性（静脉或者口服）给药一种非活性的药物前体（前药），这个前药在特异性酶（前药激活酶）的作用下激活为有活性的药物。因此，理想情况下是直接将编码前药物激活酶的基因转移到肿瘤上，使得前药只在表达这种酶的肿瘤细胞内局部激活成细胞毒性药物，从而对肿瘤细胞进行精准的杀伤。

    为了最大限度地发挥这种方法的益处，必须使细胞毒性前药能够通过细胞膜扩散进入肿瘤细胞内部杀伤肿瘤细胞，或者活性药物分泌出肿瘤细胞外面杀伤邻近的肿瘤细胞，因为转基因并不是在所有的肿瘤细胞中都有表达。这种所谓的“旁观者”效应不仅会导致能激活为活性药物的肿瘤细胞死亡，而且还会导致邻近不表达转基因的肿瘤细胞死亡。除了毒性活性药物的这种直接作用外，杀伤的肿瘤细胞还可以诱导由NK细胞、T细胞和巨噬细胞介导的宿主免疫反应，并伴随着各种细胞因子水平的增加，从而进一步增强GDEPT的治疗效果。

    基因工程的MSC表达自杀基因（胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶和羧酸酯酶），已被证明对脑瘤、卵巢癌、肝细胞癌、胰腺癌、肾癌或甲状腺髓样癌、乳腺癌和前列腺癌以及肺转移有显著的抗肿瘤反应。

    到目前为止，使用的两种最常见的前药物活化酶和前药物组合包括：(1)单纯疱疹病毒（HSV-TK）的胸苷激酶基因与更昔洛韦（GCV）联合使用。GCV是一种无毒的嘌呤类似物，HSV-TK将其磷酸化成单磷酸型。宿主细胞激酶然后完成转化为活性三磷酸型，后者抑制DNA合成，导致诱导凋亡。(2)大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶（CD）基因与5-氟胞嘧啶（5-FC）结合。胞嘧啶脱氨酶催化无毒的5-FU分子水解脱氨为5-氟尿嘧啶(5-FU)，然后在细胞内转化为其他细胞毒性代谢物，并结合到DNA和RNA中，导致细胞周期阻滞和凋亡。这两种组合都已在体外和临床前对多种人类肿瘤的动物进行了成功的测试。这些研究表明，GCV和5-FU的活性三磷酸形式都可以自由地在细胞膜上扩散，以发挥强烈的旁观者效应。然而，不幸的是，这种方法的治疗成功已经相当有限，主要是由于缺乏特异性和低效率的直接基因传递到活体肿瘤细胞。MSC作为基因载体比较好地解决了非特异性和低效率的问题，静脉输注后，趋化到肿瘤部位中的MSC将前药激活为其细胞毒性代谢物，然后将其泵出到局部微环境中杀死邻近的肿瘤细胞。

4，制备疫苗

    利用MSC制备疫苗，可以说是目前最新颖的MSC改造应用技术。2020年6月21日，我国科学家在预印本网站bioRxiv 上发布了未经同行评审的最新研究成果，文章题目为“Engineered human mesenchymal stem cells as new vaccine platformforCOVID-19”，报道了新型的基于间充质干细胞开放新冠疫苗的策略。

    将表达核衣壳蛋白（N）的质粒转染MSC，48小时后的平均转染效率约为20%。每只小鼠（C57BL/6）分别通过肌肉内（IM）或皮下（SC）途径注射总共100万个SARS-CoV-2-N-MSC细胞。免疫20天后，这种经过改造的MSC细胞能分泌新冠病毒的核衣壳蛋白，小鼠免疫系统识别到新冠病毒的核衣壳蛋白，从而产生针对核衣壳蛋白的抗体。在这个实验中，几乎所有免疫小鼠血清中都有抗体产生，其中至少有50%的小鼠在单次注射后出现强阳性抗体表达；而且没有观察到注射后的小鼠有任何更严重的症状。然后将SARS-CoV-2的结构蛋白S、N和M共转染，再次观察到对N蛋白的抗体应答增强，多次注射可获得潜在的更高信号。

小结
    MSC作为基因传递的细胞载体，最重要的特点是在体外具有很高的可操纵性。基因操作可以使用各种载体，包括慢病毒、逆转录病毒和质粒载体等。需要注意的是，用于MSC基因工程的病毒转导方法尽管具有高转染效率，但存在染色体不稳定、插入突变和原癌基因激活的高风险。相信随着科技的发展，这种高风险会得到不断地降低，MSC基因改造的安全性得到更好的保障。另外，MSC在体内的分布有一定的分散性，即注意基因工程MSC并不是全部趋化到肿瘤组织部位，即出现脱靶沉积。

    简而言之，MSC本身的诸多优点，使得MSC成为一个很好的科研和应用的工具。利用好这个工具，将有利于攻克严重威胁人们生命健康的疑难疾病，促进人们的身体健康和延年益寿。